Полноэкзомное секвенирование (США) WES

Полноэкзомное секвенирование (WES) — это современный и максимально информативный метод генетической диагностики. Он позволяет одновременно проанализировать все белок-кодирующие участки генома человека — около 20 000 генов, где сосредоточено до 85 % всех известных патогенных мутаций.

Что такое экзом

Экзом — это совокупность участков ДНК, которые содержат информацию для синтеза белков. Хотя эти участки составляют всего около 1 % всего генома, именно здесь возникает большинство генетических изменений, приводящих к наследственным заболеваниям.

Что исследует полноэкзомный анализ WES

Полноэкзомное секвенирование позволяет выявлять широкий спектр изменений в ДНК, включая:

• однонуклеотидные варианты (SNV) — замены одной «буквы» ДНК;
• небольшие вставки и делеции (indel);
• более крупные делеции и дупликации (CNV);
• и варианты в митохондриальном геноме, который также секвенируется полностью.

Таким образом, WES охватывает как ядерный, так и митохондриальный геном, что делает исследование максимально информативным и клинически значимым.

Когда показано полноэкзомное секвенирование

• при сложных или неспецифических симптомах, когда трудно определить причину заболевания;
• при подозрении на генетически гетерогенное заболевание (разные гены вызывают сходные проявления);
• если целевые генетические тесты недоступны или дали отрицательный результат;
• при необходимости повторного анализа ранее неясных случаев.

Технические характеристики метода

Для анализа используется технология полного захвата экзома и высокопроизводительное секвенирование нового поколения (NGS) на платформах Illumina NovaSeq / NextSeq (paired-end, 2×150 bp). Все этапы выполняются в лаборатории, аккредитованной по стандартам CLIA, CAP и ISO 15189, что гарантирует клинический уровень качества данных.

• Метод обогащения: полный экзомный захват, включая UTR и митохондриальный геном
• Среднее покрытие экзома: 150× (в среднем 140–180×)
• Покрытие ≥20×: более 99 % экзомных участков
• Чувствительность SNV: 99,7 %, специфичность >99,99 %
• Чувствительность indel: 97,0 %, специфичность >99,99 %
• Обнаружение CNV: высокая точность для делеций и дупликаций (чувствительность >92 % для 1 экзона, >98 % для ≥5 экзонов)
• Точность анализа: повторяемость и воспроизводимость — 99,7 %
• Митохондриальный геном: секвенируется полностью с глубиной покрытия >1000× и охватом ≥99,9 % — включён в каждое исследование WES
• Обработка данных: выравнивание прочтений на эталонный геном и последующий поиск изменений (вариантов) с использованием проверенных алгоритмов клинического уровня
• Интерпретация: каждая найденная замена или делеция проходит фильтрацию и проверку по международным базам данных — ClinVar, gnomAD, OMIM, HGMD и другим
• Классификация вариантов: проводится по критериям Американского колледжа медицинской генетики (ACMG, 2015) с разделением на категории: патогенный, вероятно патогенный, вариант с неопределённым значением, вероятно доброкачественный и доброкачественный
• Выдача данных: BAM и VCF-файлы доступны опционально

Клинический анализ и интерпретация

После секвенирования данные проходят многоуровневую биоинформатическую обработку. Специализированные алгоритмы сопоставляют миллионы прочтений с эталонным геномом, выделяя клинически значимые варианты. Каждый из них оценивается и классифицируется по международным критериям ACMG (2015).

В отчёт включаются только изменения, связанные с клиническими проявлениями у конкретного пациента. Это могут быть:

• гетерозиготные варианты при аутосомно-доминантных заболеваниях;
• гомозиготные или сложные гетерозиготные при аутосомно-рецессивных;
• гемизиготные при Х-сцепленных заболеваниях.

Ограничения метода

Метод не выявляет:

• сбалансированные транслокации и инверсии;
• генные конверсии;
• экспансии повторов (например, болезни из группы триплетных повторов);
• варианты за пределами ±20 пар оснований от экзон-интронной границы;
• структурные перестройки, не сопровождающиеся изменением числа копий.

Метод может иметь пониженную чувствительность при:

• низком уровне мозаицизма (доля мутантного аллеля < 15 %);
• наличии псевдогенов и дублированных регионов;
• инсерциях или делециях длиной более 50 пар нуклеотидов;
• вариантах в сегментально дуплицированных областях генома.

Что происходит после теста

Если выявлен патогенный вариант, его можно подтвердить методом Сэнгера у родственников для уточнения наследования. Если изменений не обнаружено, это не исключает генетическую природу заболевания — некоторые варианты пока не описаны в научной литературе или не детектируются данным методом.

Пациент может заказать пересмотр данных через 12–24 месяца. При пересмотре учитываются обновлённые базы данных и новые публикации. Лаборатория предоставляет один бесплатный пересмотр (варианты, указанные ранее в отчёте) и полную услугу повторного анализа с новым секвенированием при необходимости.

Преимущества WES в нашей лаборатории

• Международное признание и аккредитации. Анализ выполняется в международной лаборатории Blueprint Genetics, входящей в корпорацию Quest Diagnostics (США). Лаборатория сертифицирована по стандартам CLIA, CAP и ISO 15189, что гарантирует качество клинического уровня на каждом этапе — от выделения ДНК до интерпретации результатов.
• Полный охват экзома и митохондриального генома. Анализ включает все белок-кодирующие гены человека (≈ 20 000) и весь митохондриальный геном, обеспечивая максимальную диагностическую информативность.
• Выявление не только точечных, но и крупных изменений. Тест определяет однонуклеотидные варианты, небольшие вставки и делеции, а также делеции и дупликации (CNV) по всему экзому — с высокой чувствительностью даже для отдельных экзонов.
• Расширенный охват генома. Помимо кодирующих областей, анализ включает около 1500 клинически значимых некодирующих вариантов, которые могут вызывать заболевания и обычно не входят в стандартные панели других лабораторий.
• Передовые технологии секвенирования. Используются платформы Illumina NovaSeq / NextSeq и методы глубокого секвенирования (среднее покрытие ≈ 150×), что обеспечивает равномерное покрытие всех генов и исключительную точность данных.
• Точная клиническая интерпретация. В отличие от многих лабораторий, мы не предоставляем перечень всех найденных изменений. В итоговом отчёте указываются только клинически значимые варианты, которые могут быть связаны с симптомами пациента. Для каждого варианта приводится развёрнутое клиническое описание — почему он может (или не может) объяснять наблюдаемый фенотип, с анализом всех доступных научных публикаций и данных из международных баз.
• Собственный биоинформатический анализ и контроль качества. Blueprint Genetics применяет усовершенствованный программный конвейер анализа и многоуровневую систему проверки, что обеспечивает высокую точность и воспроизводимость результатов.
• Распознавание редких и некодирующих вариантов. В анализ включено около 1500 известных некодирующих патогенных вариантов, которые часто не входят в стандартные панели других лабораторий.
• Прозрачность и возможность пересмотра. По желанию можно получить исходные данные секвенирования (.BAM, .VCF) и заказать бесплатный пересмотр результатов по мере появления новых научных данных.

Что дальше?

Если анализ WES выявил варианты, являющиеся возможной причиной болезни, можно проверить наличие этих вариантов у родителей. Анализ отдельных мутаций по Сэнгеру.

Если анализ не выявил вариантов, это означает, что науке пока неизвестен вариант, или его нельзя определить методом полноэкзомного секвенирования короткими прочтениями (NGS второго поколения).

Возможно получить сырые данные и делать пересмотр данных или повторный анализ каждые несколько лет. Возможно, со временем науке станут известны новые генетические факторы заболевания.

Лаборатория предоставляет один бесплатный пересмотр данных, рекомендуется заказывать это по истечении 12 месяцев, или если появились новые симптомы, но не позднее 24 месяца от даты получения результата. В этой опции пересматриваются только варианты, которые были ранее в результате.

Также лаборатория предлагает повторный анализ данных. Во время повторного анализа образец секвенируется повторно и проходит полный анализ.

Образец результата WES

Клиническая история

Больной мальчик 2 лет с подозрением на аутизм, задержкой мелкой моторики, задержкой речи, гипертонусом и двусторонним крипторхизмом. Не разговаривает почти 2 года. Очень плохо спит. На имя не реагирует. Не жует, ест только сбитую блендером еду. Имеет длинный фильтр, загнутые ноздри, гипертрихоз, плоскостопие. Нет сообщений о подобном заболевании в семейном анамнезе. Предварительное генетическое исследование, проведённое в других лабораториях: Кариотип 46, XY. Синдром Смита Магениса: не подтвержден.

Результат полноэкзомного секвенирования

Анализ полного экзома выявил гетерозиготный вариант ANKRD11 c.1903_1907del, с. (Lys635Glnfs*26). Вариант ANKRD11 c.1903_1907del, p.(Lys635Glnfs*26) классифицируется как патогенный на основе имеющихся в настоящее время данных, подтверждающих его болезнетворную роль. Заболевание, вызванное вариантами ANKRD11, наследуется по аутосомно-доминантному типу. Заболевание, связанное с ANKRD11, обычно вызвано вариантом de novo. Рекомендуется генетическая консультация и тестирование членов семьи.

Как подготовиться

Требования сдачи крови натощак нет

Пересадка костного мозга является противопоказанием.

В случае переливания крови, необходимо делать забор не ранее чем через 3 недели

Необходимо предоставить заключение врача с описанием симптомов и предварительным диагнозом, желательно фото исследуемого пациента (если есть фенотипически значимые особенности), заполнить в электронном виде анкету.

По результатам анализа обязательна консультация врача-генетика для интерпретации отчёта и обсуждения дальнейших шагов.

Дополнительная информация

Что такое полноэкзомное секвенирование?

Читать статью