Що таке повноекзомне секвенування?

Що таке повноекзомне секвенування?

Дата: 16.06.2023

Ваш лікар запропонував вам або члену вашої родини тест під назвою «Секвенування повного екзому» (WES)? Які переваги і недоліки? Як інтерпретувати результати повноекзомного секвенування? Объясняем простыми словами.

Аналіз Повноекзомне секвенування (англ. WES whole exome sequencing) — це метод секвенування, який дозволяє досліджувати екзом, тобто є повний набір екзонів, що кодують області геному. Є в даний час методом першої лінії, тобто є початковим тестом у разі підозріння на генетичне захворювання.

Основи генетики для розуміння повноекзомного секвенування (WES)

Тіло людини складається з клітин, ядро клітин містить ДНК (дезоксирибонуклеїнова кислота). Молекула ДНК складається з чотирьох хімічних сполук (нуклеотидів), позначених буквами A, T, C і G (аденін, тімін, цитозин і гуанін). Гени - це участки ДНК.

Кожен чоловік має близько 20 000 генів у кожній клітці свого тіла; ми успадковуємо половину наших генів від нашої матері і іншу половину від нашого отца. Гени — це інструкції, які контролюють все в нашому організмі, включаючи наше розвиток, ріст і здоров'я.

Гени організовані в екзони та інтрони. Екзони («експресовані регіони», «виражені ділянки») — це кодуючі області гена. Вони містять інформацію, яка використовується для виробництва білків, необхідних для нормального росту, розвитку і функціонування органів. Якщо виробляється неправильний білок або не виробляється взагалі, то виникає захворювання. Інтрони (внутрішні регіони, "внутрішньогенний регіон") є некодуючими областями гена та часто містять важливу технічну інформацію.

Вся наша генетична інформація, включаючи інтрони та екзони, називається геном. Повний його запис у вигляді молекул ДНК представлений послідовністю приблизно з 3 мільярдів нуклеотидів. Екзом становить всього близько 1% всього генома людини, однак містить близько 85% ідентифікованих генетичних варіантів, що викликають захворювання.

Екзом — це совокупність екзонів. Це частина генома, яка відповідає за синтез білка в організмі.

Усі люди мають деякі відмінності в своєму екзомі порівняно з екзомом іншої людини. Це робить кожен із нас унікальним! Іноді у людей є генетичні відмінності або генетичні варіанти, із-за яких один або кілька генів перестають працювати або працюють інакше, чим очікувалося. Ці генетичні варіанти (мутації) можуть привести до генетичного захворювання.

Що таке повноекзомне секвенування (WES)?

Більшинство генетичних варіантів, що викликають генетичні захворювання, знаходяться в екзомі.

Повноекзомне секвенирование (WES) — це технологія секвенування наступного покоління, в якій екзони секвенуються та аналізуються на наявність специфічних мутацій. Якщо аналіз екзоми пацієнта виявляє певну мутацію, що викликає захворювання, то лікування може бути більш ефективним.

Повноекзомне секвенування аналізує послідовність ДНК, що міститься у всіх багаточисельних екзонах наших 20 000 генів. Цей WES відрізняється від інших генетичних тестів, які можуть перевірити лише деякі мутації, один або кілька генів.

WES виконується за допомогою технології секвенування нового покоління (NGS), що дозволяє одночасно аналізувати велику кількість генів. ДНК виділяється із зразка крові пацієнта. Найпопулярніший в даний час метод NGS, а саме секвенування на приладах Illumina, використовує короткі проточки, щоб є ДНК розбивається на дрібні фрагменти, вони секвенуються, а потім за допомогою комп'ютерної програми відбувається вирівнювання послідовностей фрагментів ДНК на еталонний геном (референс).

Таким чином ДНК пацієнта порівнюють з референсною послідовністю ДНК людини в спробі знайти будь-які відмінності між ДНК пацієнта та еталонною ДНК. Якщо є які-небудь відмінності, вони розглядаються досвідченими лабораторними генетиками та лікарями-експертами.

Кому рекомендовано повноекзомне секвенування (WES)?

WES можна робити під час вагітності, у дитинстві чи у дорослому віці. Зазвичай це відбувається з наступних причин:

Найчастіше екзом проводиться для дітей, які страждають від таких хвороб, як епілепсія, розлади аутистичного спектру, лейкодистрофія, спадковий рак. Ранній початок хвороби свідчить про високу ймовірність генетичної причини.

Кому НЕ рекомендоване повноекзомне секвенування (WES)?

WES може бути не ідеальним тестом для вас або вашої дитини, якщо:

Чим WES відрізняється в різних лабораторіях?

Багато генетичних лабораторій пропонують тестування WES. Іноді може бути важко вирішити, чому варто вибрати одну лабораторію замість іншої. На що звертати увагу?

Покриття. Це глибина секвенування, обозначає, скільки разів кожен нуклеотид, тобто будь-яка буква в екзомі була прочитана в процесі секвенування.

Зазвичай в WES застосовують покриття від 50х до 150х, що означає, що кожен нуклеотид в екзомі був прочитаний 50-150 разів. Більш високе покриття може забезпечити більш точні результати та підвищити ймовірність виявлення генетичних варіантів, включаючи рідкі або мозаїчні мутації. Считается важливим показником відсоток екзоми з покриттям не менше 20х.

Вот так виглядає опис покриття в результаті повноекзомного секвенування:

Обсяг тестування.
Чи тестуються делеції та дублікації (CNV)?
Чи входять в аналіз клінічно значущі некодуючі варіанти інтронів?
Чи входить мітохондріальний геном в тестування екзому?

Указані обмеження тесту. В описі тесту та висновках повинні бути чітко вказані всі обмеження, які мають WES.

Результати в зрозумілому вигляді. Не просто перелік всіх виявлених варіанти, а пріоритізовані з урахуванням фенотипа, тобто симптомів пацієнта. Заключення, в якому вказані всі знайдені варіанти, включаючи нешкідливі, може заплутати пацієнта та свідчить про недостатньо оброблений звіт.

Сирі дані. Надає чи лабораторні сирі дані? В каких форматах? Кощтує це додатково або безкоштовно за запитом?

Перегляд даних. З протягом часу наука відкриває всі нові варіанти, пов'язані з генетичними захворюваннями. Якщо результат секвенування не найшов причину хвороби, є сенс піддавати дані повторної обробки. Деякі лабораторії пропонують безкоштовний повторний аналіз даних через кілька років.

Які переваги WES?

Генетичне тестування може допомогти:

Чи входить мітохондріальний геном у повноекзомне секвенування?

Мітохондріальний геном (мтДНК) являє собою генетичний матеріал, що знаходиться всередині мітохондрій - органел клітин, відповідальних за виробництво енергії. Мітохондрії мають свою власну ДНК, відмінну від ядерної ДНК, і мітохондріальний геном успадковується від матері. Тобто мітохондріальна ДНК не входить в екземпляр.

Некоторие спадкові захворювання пов'язані з мутаціями в мітохондріальному геномі. Включення мітохондріального генома в повноекзомне секвенування дозволяє обнаруживать і аналізувати такі мутації, тому мітохондріальний геном входить в повноекзомне секвенування в деяких лабораторіях.

Входить чи некодуюча ДНК у повноекзомне секвенування?

Некодирующие послідовності, такі як інтрони, не входять в екзом. Вони не містять інформації про послідовність амінокислот, яка визначає структуру і функцію білка. Однак в деяких лабораторіях повноекзомне секвенування дозволяє секвенувати та аналізувати як екзомні, так і некодирующие послідовності, що може бути корисним при пошуку варіантів, що викликають хвороби. Наприклад, лабораторія Blueprint Genetics (США) тестує 2000 клінічно релевантних некодуючих варіантів, а лабораторія Cegat (Німеччина) аналізує 33500 інтронних некодуючих варіантів, що наближає цей аналіз до повногеномного секвенування.

Чи визначає повноекзомне секвенування хромосомні перебудови?

Так, повне екземплярне секвенування може допомогти у виявленні хромосомних перебудов. Хромосомні перебудови - це структурні зміни хромосом, такі як делеції, дуплікації, інверсії та транслокації, які можуть впливати на функцію генів і бути пов'язані з різними генетичними розладами та захворюваннями.

При повному екзомному секвенуванні відбувається секвенування екзомних областей генома, які представляють собою лише невелику частину геному. Проте в ході аналізу секвенованих даних можна виявити патологічні зміни в екзонах, які можуть вказувати на наявність хромосомних перебудов.

Для більш точного виявлення хромосомних перебудов можуть бути використані додаткові методи аналізу, такі як хромосомний мікроматричний аналіз (Array CHG) або методи, засновані на цитогенетичних техніках (наприклад, флюоресцентна гібридізація in situ - FISH). Ці методи дозволяють відновити структурні зміни на рівні всього генома і надати більш повну картину хромосомних перебудов.

Яка ймовірність дізнатися діагноз за допомогою повноекзомного секвенування?

Кількість пацієнтів, яким ставиться діагноз після аналізу повної екзоми, вар'юється, але, за оцінками, становить від 25 до 50%. Традиційне генетичне тестування, як-то аналіз окремих мутацій, в меншої кількості випадків призводить до постановки діагнозу.

Пацієнти з більшою ймовірністю отримують діагноз за допомогою WES, якщо у них є серйозне захворювання, що загрожує кілька системних органів, і симптоми почалися в ранньому віці.

Діагноз також більш віроятний, коли батьки надають зразки разом з пацієнтом (тріо).

Чи потрібно іншим членам сім'ї надавати зразки?

WES може виконуватися лише із зразком пацієнта. Інші члени сім'ї не зобов'язані здавати зразки, тим більше, що це підвищує вартість тестування. Однак, коли аналіз включає зразки інших членів сім'ї, ймовірність встановлення діагнозу для пацієнта вище. Аналіз, в якому участвует хворий і його батьки, називається тріо і є кращим способом повного екземпляра секвенування. У деяких випадках може бути корисно включити зразки інших членів сім’ї (наприклад, братів і сестер).

Мутація, тобто поломка гена, може виникнути у дитини через помилки копіювання ДНК, у такому випадку вона називається de novo.

У випадку, якщо обидва батьки є носіями гетерозиготного варіанту, то є Aa, один нормальний ген і один дефектний, то ребенок може унаслідувати від обох батьків поломанний ген і отримати генотип aa, обидва дефектних гени.

Варто звернути увагу на те, що ціль аналізу повного екзому — знайти відповідь на симптоми у пацієнта, а не знайти всі генетичні варіанти у кожного тестованого члена сім’ї. Якщо зразки отримані від пацієнта та одного чи кількох членів сім’ї, усі варіанти, що викликають симптоми симптомів пацієнта, а також те, що вони були попереджені або виникли вперше, включають у звіт пацієнта. Вторичні результати для членів сімей, які беруть участь в аналізі WES, повідомляються в окремих індивідуальних звітах, якщо інші члени сімей хочуть отримати цю інформацію.

Які результати містить звіт WES?

WES дає чотири різні типи результатів:

Патогенний або ймовірно патогенний варіант гена, який: 1) відомий як викликає захворювання або з ймовірністю викликає високе захворювання, і 2) пов’язаний із симптомами у пацієнта. Цей результат можна використовувати для тестування інших членів родини, щоб дізнатися, чи можуть вони бути затронуті через генетичне захворювання.

Варіант невизначеного значення (VUS) в гені, який, як відомо, викликає захворювання. Цей результат означає, що виявлено зміни в гені, і цей ген пов'язаний із симптомами у пацієнта. Однак виявлений варіант ще недостатньо вивчений, щоб сказати, що це варіант фактичної причини захворювання. Тестування інших членів родини на VUS може бути корисним для розуміння, чи є варіант причиною захворювання. Не рекомендується використовувати цей результат, щоб визначити, чи підлягають інші члени сім’ї ризику розвитку захворювання.

Варіант з невизначеною значущістю (VUS) у гені, про який раніше не було відомо, що він викликає захворювання. Цей результат означає, що було виявлено зміну в гені, і тип варіанта зазвичай викликає генетичне захворювання. Однак недостатньо знає ген недостатньо вивчений, щоб сказати, чи пов'язаний він із захворюванням людини. Це називається ген-кандидат. Необхідні додаткові дослідження, щоб підтвердити, чи пов'язаний ген із симптомами пацієнта. Ми не рекомендуємо використовувати цей результат, щоб визначити, чи підлягають інші члени сім’ї ризику розвитку захворювання.

Негативний результат означає, що не було виявлено будь-яких істотних змін в генах, пов’язаних з відомими лабораторії симптомами пацієнта.

Негативний результат може означати, що:

Пример знайденого патогенного варіанту

Найдений варіант гена FGFR3, його номер у базі даних dbSNP: rs28931614.

Варіант класифікований як патогенний, міссенс-варіант, тож цей варіант змінює сенс ДНК, що призводить до створення іншої амінокислоти замість потрібної, а потім і іншого білка.

Стан гетерозиготний, тобто є мутація тільки в одній копії гена, друга копія - нормальна.

Наслідується аутосомно-домінатно (AD) і аутосомно-рецесивно (AR).

c.1138G>A, p.(Gly380Arg) представляє собою опис генетичного варіанту у форматі HGVS (Human Genome Variation Society).
c.1138G>A:
"c." вказує на координату в кДНК (комплементарна ДНК).
"1138" представляє позицію нуклеотиду в гені, де відбувається зміна.
"G" вказує на вихідний нуклеотид у цій позиції.
"A" вказує на змінений нуклеотид, який замінив вихідний.
p.(Gly380Arg):
"p." вказує на амінокислотну послідовність (білок).
"Gly380" означає амінокислоту гліцину в позиції 380.
"Arg" означає заміну гліцину на амінокислоту аргінін.

Таким чином, даний опис вказує на генетичну варіацію, де в гені виникла заміна нуклеотиду G на нуклеотид A в позиції 1138 (Ref/Alt G/A), що призводить до заміни амінокислоти гліцину на амінокислоту аргінін в позиції 380 білка.

В базі даних gnomAD значення AC/AN рівне 0/250348. Це означає, що в популяції не було виявлено жодного екземпляра варіантного алеля, із загального числа 250348 алелей, врахованих у цьому виборі. Це дуже рідкий варіант.

Ідентифікатор NM_000142.4 використовується для позначення конкретного варіанта гена транскрипту в базі даних RefSeq.

Референсна послідовність генома людини - GRCh37/hg19, цей параметр достатньо встановлений. Саме з цим еталоном порівнюється наша послідовність, і відповідно до нього визначається координата 4: 1806119. Координата означає 4-й хромосом і конкретний номер позиції варіанту.

Polyphen, SIFT, Muttaster - комп'ютерні програми, які прогнозують вплив зміни нуклеотиду на функцію білка, називається аналіз in silico (комп'ютерне моделювання). Як можна побачити, вони по-разному прогнозують цей вплив, мутація названа як доброякісної, так і викликає хворобу.

Фенотип, асоційований з варіантом, поєднується з клінічною картиною пацієнта.

Що таке вторинні результати?

Вторичним результатом є генетичний варіант, ідентифікований WES, який може викликати серйозне захворювання гена, яке не пов’язане з симптомами пацієнта. Звіт повідомляє про вторинні результати, оскільки якщо вони виявлені, є заходи, які можна прийняти, такі як операція або скринінг, які можуть допомогти знизити ймовірність розвитку захворювання. Американська організація ACMG, яка задає стандарти в області медичної генетики, рекомендує повідомляти про вторинні результати тільки для певної кількості генів.

Вторинні результати включають у звіт тільки при згоді пацієнта. Вторинні результати для батьків та інших членів сім’ї повідомляються в окремому звіті, щоб забезпечити конфіденційність для кожної людини.

Що включається в результат повноекзомного секвенування?

Результат WES містить інформацію про патогенні варіанти, ймовірно патогенні варіанти і варіанти невизначеної значущості (VUS) в генах, які, як відомо, виявляють захворювання людини, а також у генах-кандидатах, пов’язаних із симптомами пацієнта.

Якщо члени сім’ї брали участь в аналізі WES, звіт пацієнта також міститиме інформацію про те, чи були варіанти, утрачені від матері чи відця, або це варіант de novo, то є нове генетичне зміна у пацієнта, яке не було услідковано.

Якщо пацієнт або батьки погоджуються, звіт також міститиме вторинні результати щодо патогенних або ймовірн патогенних варіантів.

Що НЕ включається в результат повноекзомного секвенування?

Хотя WES дозволяє нам побачити велику кількість генетичних варіантів у кожному екземплярі людини, повідомляється не про всі виявлені варіанти, оскільки це означало громоздкий звіт із тисячами варіантів і невеликим розумінням їх значення.

У звіт WES НЕ включено:

Первинні (сирі) дані

Сирі дані повноекзомного секвенування можуть бути представлені в різних форматах, залежно від використаної платформи та інструментів аналізу. Найбільші форми форматів сирих даних:

Які обмеження WES?

Технологія WES є відносно новою. В даний час неможливо захопити й секвенувати 100% екзоми з високою якістю. У кращому випадку секвенується в середньому >99,4% екзоми з надійною якістю виявлення генетичних варіантів.

Крім того, наука ше не до кінця розуміє екзом людини; як наслідок, ми не можемо розпізнати варіанти в деяких генах як причину симптомів пацієнта. Також тест може пропустити варіанти в інших генах із-за обмежених технологій.

Наприклад, повноекзомне секвенування не може обнаружити експансію повторів, тобто такі хвороби, як Хорея Гентінгтона, синдром ломкої хромосоми (Мартіна Белла), підвищене число трьохбуквенних повторів (наприклад, CAG CAG CAG), необхідно перевірити спеціальними тестами. Крім того, можуть бути невидимі такі хромосомні відхилення як збалансовані трансклокації, інверсії. Ці та інші обмеження пов'язані з методом коротких прочтінь. Методи наступного покоління, які мають довгі прочтіння, будуть мати інші обмеження.

З цієї причини важливо пам’ятати, що нормальний результат WES не виключає генетичну причину симптомів пацієнта.

Як довго виконується повноекзомне секвенування?

Аналіз WES є складним. Необхідний час для проведення тесту та огляду даних і наявної наукової літератури, щоб інтерпретувати результати. З цієї причини отримання результатів може тривати до 8–10 тижнів.

Як замовити аналіз і куди надсилаються результати?

Аналіз повноекзомного секвенування може замовити лікаря або пацієнта, заповнивши спеціальну форму з клінічною картиною та додавши наявні дослідження та заключення лікарів. Результаты надилаються лікурю, що замовив тестування. Важливо, щоб ваш лікар обговорив з вами результати, щоб допомогти вам отримати їх і скласти план подальших дій.

В результаті повноекзомного секвенування було виявлено патогенний варіант. Що далі?

Підтвердження та аналіз мутацій: це може включати додаткові лабораторні дослідження, функціональний аналіз або порівняння з базами даних генетичних варіантів.

Консультація врача-генетика: лікар проведе детальне обговорення результатів секвенування, пояснить значення мутації, її можливі наслідки та рекомендації щодо подальшіх дій.

Уточнення клінічного значення мутації: Якщо патогенний варіант вже відомий науці та пов’язаний із конкретним генетичним синдромом або захворюванням, лікарі можуть провести додаткове клінічне обстеження пацієнта, щоб оцінити наявність або ризик розвитку, пов’язаних із мутацією симптомами чи захворюванням.

Рекомендації щодо лікування та уходу: спостереження, медикаментозна терапія, хірургічне втручання, зміна образу життя або інші заходи для мінімізації ризиків і симптомів, пов’язаних з мутацією.

Сімейне тестування: якщо виявлено патогенну мутацію, може бути рекомендовано тестування інших членів сім’ї для виявлення наявності мутації або ризику її услід. Тестування на окремі мутації частіше всього проводиться методом секвенування по Сенгеру.

Мій результат негативний. Які наступні кроки?

Деякі люди отримають негативний результат WES. Важливо пам'ятати, що це не гарантує відсутність генетичної причини ваших симптомів. Поговоріть зі своїм лікарем про те, чи рекомендує він додаткове тестування.

Возможним кроком може бути повне секвенування генома. Пам'ятайте, що екзом - це 1% від усієї ДНК. Хоча більшість варіантів покриваються екзомом, деякі варіанти можуть знаходитися за рамками екземплярів і включених в екземпляр інтронних варіантів.

Также, можна повторно проаналізувати первинні дані через інший час. Наука на місці, кожен рік реєструється безліч нових генетичних варіантів, які можуть бути причиною захворювання.

Чи дізнаюсь я з аналізу повного екзому своє походження, схильність до хвороб або рекомендації щодо запитання?

В загальному випадку, ні. Тестування екзому не ставить ціль надати таку інформацію. Лабораторія прагне з максимальною якістю знайти той рідкий варіант, який міг би стати причиною генетичного захворювання, і не перевантажувати звіт доповненнями, що не мають відношення до симптомів. Сирі дані можуть містити подібну інформацію, але їх біоінформаційна обробка буде дорого коштувати для задоволення допитливості. Справа в тому, що популярні генетичні аналізи для здорових людей містять близько 700 000 варіантів, а повний екзом - більше 30 мільйонів варіантів, причому в тому випадку аналіз інтерпретації екзома проводиться вручну висококваліфікованими вченими.

Якщо потрібен тест ДНК, який дає інформацію про поширені варіанти популяції та пов’язані з ними передумовами, у вигляді відомого звіту можна замовити інші тести. Наприклад, 23 and Me, або Етнический состав c дополнительными отчетами, Здоровий вес.

Чи можу я замовити повний екзом для планування вагітності?

Повноекзоомное секвенування служить для того, щоб знайти причину захворювання у хворої людини. Зазвичай лабораторії не приймають зразки з метою скринінгу на всі можливі патогенні варіанти. Є тести ДНК на основі секвенування NGS, які спеціально створені для підготовки до вагітності та враховують ДНК обох супругів.

Що краще замовити - повний геном, панель або повний екзом?

Вибір між панеллю генів, екземплярним секвенуванням і повним геномним секвенуванням залежить від конкретних цілей і питань дослідження, а також від доступних ресурсів.

Панель генів:

Найкраще використовувати, коли вам відомі конкретні гени або передбачається конкретне захворювання. Якщо протягом цього часу виявиться, що причина хвороби може бути в іншому гені, дані ДНК не будуть містити цю інформацію.

Економічно вигідно, коли вам потрібно проаналізувати лише обмежений набір генів. При цьому покриття вибраних генів зазвичай дуже високе.

Екзомне секвенування:

Найкраще використовувати, коли ви хочете отримати більш повну інформацію про генетичні варіанти у всіх кодуючих регіонах генома.

Корисно для досліджень генетичних захворювань, коли ви хочете досліджувати не лише попередньо визначені гени, але й усі відомі гени та редкі варіанти в них, які можуть бути пов’язані з хворобою.

Повне геномне секвенування:

Секвенування всього генома аналізує весь геном, у той час як WES аналізує лише екзомні області геному. Але покриття в повному геномі зазвичай нижче, ніж в екзомі.

Найкраще використовувати, коли вам потрібна найбільш повна інформація про геном, включаючи некодовані області, структурні варіації та можливі регуляторні елементи. Потрібно поняти, що багато їх цих варіантів ще невідомі науці. У разі перегляду даних геном забезпечує найбільш багаті можливості, так як секвенирована практично вся ДНК.

Повне геномне секвенування є найбільш повним дослідницьким підходом, але також самим затратним і потребує більш вичерпних ресурсів для обробки даних.

Заключення

Повноекзомне секвенування (англ. Whole Exome Sequencing, WES) є потужним інструментом для ідентифікації генетичних причин захворювань, особливо в тих випадках, коли інші методи діагностики не дають достатньої інформації. Однак воно також може бути дорогим і вимагати додаткового часу та ресурсів для аналізу та інтерпретації отриманих даних.

Автор: Марина Савельева
Молекулярный генетик, биоинформатик